Em postagem anterior falamos sobre como manusear um microscópio. Hoje iremos explicar como preparar uma lâmina para analises histopatológicas.
É importante saber que existem muitas outras técnicas de coloração, mas algumas são caras demais e muito trabalhosas, o que acaba sendo inviável. A técnica da parafina é a mais utilizada pois é barata, e simples de fazer pois requisita um tempo relativamente curto em comparação com o custo benefício que ela oferece.
Preparo de cortes Histológicos:
Os cortes são derivados da remoção de pequenas amostras representativas de tecidos, cortadas em fatias muito delgadas, apropriadas para o estudo em um microscópio. Em geral os cortes são preparados pela técnica de parafina (lâminas permanentes).
TÉCNICA DE PARAFINA PARA PREPARO DE CORTES
Amostra de Tecido:
A amostra deve ser pequena, obtida através de uma excisão cirúrgica (biópsia), ou pós morte (necropsia). Essa amostra não deve passar de 1 cm, em qualquer dimensão, pois quanto maior for a amostra, mais tempo ira demorar para ela ser fixada. Este tamanho pode variar em função do tipo de equipamento apresentado pelo laboratório, onde o corte será preparado.
| Fonte: https://encrypted-tbn3.google.com/images?q=tbn:ANd9GcS3_RmsS1Ha_JiXRh1y6w9pFTEsVb-K5fchiXcDTwlclAkvyeG4 |
Tamanho ideal de um tecido
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| Fonte: http://143.107.23.244/lido/rato/images/macro_tumor1a.jpg |
Fixação:
Os fixadores têm como objetivo endurecer os tecidos moles e prevenir a deterioração e outras alterações estruturais indesejáveis nas células e nos tecidos que serão analisados. Eles atuam como coaguladores protéicos, evitando a digestão das células pelas enzimas celulares por ela liberadas após a morte, impedindo que a amostra seja danificada para o exame microscópico. Apresentam também ação anti-séptica matando bactérias e outros agentes causadores de doenças nos tecidos infectados, que poderiam, eventualmente, ameaçar a saúde dos que manuseiam tais tecidos. O fixador mais comum é a solução de formal a 10%; outros fixadores usados são: álcool, fixador de Bouin Zenker, entre outros.
Para o transporte até o laboratório não devem ser esquecidos os requisitos fundamentais de acompanhamento: anamnese, condições de coleta, data da morte e data da coleta, dados de necropsia (se realizada). Na ausência do formol ou álcool, para transporte, pode-se acondicionar a amostra em isopor com gelo, mas deve-se evitar congelá-la, pois sua estrutura microscópica será alterada quando ocorrer o descongelamento.
Lavagem:
O primeiro passo da técnica consiste em deixar a amostra sendo lavada em água corrente por um período de 12 horas, será removido assim o excesso de formol.
Desidratação:
O objetivo da técnica de parafina é substituir a água dos tecidos pela parafina. Como a parafina não é solúvel em água, é necessário primeiro retirar a mesma da amostra de tecido. Isto é feito em dois estágios:
1º - Substituição da água por álcool - passa-se o tecido em várias soluções de álcool com o aumento de graduação na concentração, num amplo período de tempo seguindo esta ordem abaixo:
- álcool 70%: 1 a 2hs
- álcool 80%: 1h
- álcool 90%: 1h
- álcool 96%: 1h
- álcool 100% (álcool absoluto): 1h
2º - Clarificação ou Diafanização - Substituição do álcool por um solvente de parafina miscível com o álcool. Usa-se o Xilol como solvente. Passa-se o tecido em várias trocas de Xilol até que o álcool seja substituído por este. O tecido fica meio transparente.
- Xilol I: 1 h
-Xilol II: 1 h
Inclusão
Coloca-se a amostra impregnada por xilol em um cassete para poder dar o banho de parafina líquida aquecida. O tecido logo fica inteiramente saturado com parafina, sendo que, a cera líquida passa a ocupar todos os espaços do tecido, que antes continha água. Este procedimento é feito dentro da estufa. A cera endurece a medida que esfria, onde monta-se o bloco de parafina (emblocagem), para que possa ser cortado em fatias delgadas.
Cassete para preparação dos blocos
| Fonte: https://encrypted-tbn1.google.com/images?q=tbn:ANd9GcRoeR9xCnLGuIQLaSaphzNM46Y_3iQsTN61R3wezu5O-cWb0Jh86g |
Blocos prontos:
| Fonte: https://encrypted-tbn0.google.com/images?q=tbn:ANd9GcStpCXluUFiXlbfoWwZk7OrHktfPv2P9Atb8EYWeYpov_lLhhdQ |
| Fonte:https://encrypted-tbn1.google.com/images?q=tbn:ANd9GcSGoCUY0JNWhS_v3AeuQ89qeEiNnEdapcZcyf_gpAXoRoLccEPptg |
Microtomia
O bloco de parafina é então posicionado micrótomo, onde se desgasta a parafina até chegar ao corte, após gradua-se o micrótomo para cortes de 3 a 6 um, onde sairão os cortes desprendendo-se da navalha, com suas bordas aderidas aos cortes vizinhos de modo a constituir uma fita da qual, cada um deles é, individualmente, separado com facilidade.
| Fonte: https://encrypted-tbn1.google.com/images?q=tbn:ANd9GcQTpyMTsiycxp4tkWotxKbEaH-bvjriDZ6hpXPjksrOSOPN0omTZQ |
Confecção da lâmina
Os cortes são esticados em água morna, e depois colocados em lâminas contendo albumina de Meyer, para fixar o corte à lâmina. (lado brilhante voltado para o vidro). Deixar escorrer o excesso de água, e levar as lâminas para estufa, onde se deixa secar completamente e começar a derreter a parafina. Outra maneira é esticar os cortes em álcool a 20% e depois passar pela gelatina, dispensando a albumina.
Coloração
A maioria dos tecidos são incolores, o que torna difícil sua observação ao microscópio óptico. Devido a isto, foram introduzidos métodos para a coloração dos tecidos de modo a tornar seus componentes visíveis e destacados uns dos outros. A coloração é feita usando geralmente misturas de substâncias químicas denominadas corantes. A maioria dos corantes usados em histologia comporta-se como ácidos ou básicos e tendem a formar ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos. Os componentes dos tecidos que se coram facilmente com corantes básicos são chamados basófilos, sendo chamados de acidófilos os que se liga a corantes ácidos. A hematoxilina não é um corante básico, mas comporta-se como tal, ligando-se as estruturas basófilas dos tecidos. A eosina é um corante ácido. A coloração dupla pela Hematoxilina e pela Eosina (HE) é a mais utilizada na rotina em histologia.
| Fonte: https://encrypted-tbn0.google.com/images?q=tbn:ANd9GcSHdfRK7fDEY3hssl3J7DlCBHsVfp30ZiZkIX3Xt4JriH_bJscm |
Hematoxilina - coram núcleos de azul
Eosina - coram citoplasma de róseo
Técnica de coloração HE - Hematoxilina e Eosina
- Xilol - 15' - 30'
- Deixar Secar
- Álcool Absoluto - 2'
- Álcool Absoluto - 2'
- Lavar em água destilada
- Hematoxilina - 1'30''
- Lavar em água corrente
- Deixar descansando em água - 2' (até ficar meio azulado)
- Eosina - 30''
- Lavar em água - 2'
- Álcool absoluto - 2'
- Álcool absoluto - 2'
- Álcool absoluto - 2'
- Álcool absoluto - 2'
- Deixar secar
- Xilol - 20'
- Montagem em Bálsamo
- Identificação das lâminas
Observações:
Vale lembrar que infelizmente nem todas as lâminas preparadas saem com perfeição e em algumas podem ocorrer variações ou defeitos conhecidas como artefatos. Esses artefatos variam desde a formação de bolhas de ar, acumulo de cristais de corante ou de formol, até sobreposição de tecidos.
Referências:
https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:8ADflkOv7gMJ:www.urcamp.tche.br/histologia/atlas/docs_histo/POLIGRAFO_HISTOLOGIA_I.pdf+como+%C3%A9+a+t%C3%A9cnica+da+parafina&hl=pt-BR&gl=br&pid=bl&srcid=ADGEESghJecZWU9rHJZVWCeFX75YEKencshHp_eAyey7pPMZ_bV2qnPhIqF5mhG4we1IDa5CGt9eSUn-BYKD0UmSn0FJpIK9MX1ER43hauMqPkhYuSgiia1HT3tIRHIvHx6oQmnn5_vu&sig=AHIEtbSw3l7j1qcITKDOZhLP1Y-yqsdX0Q
Outro site que pode ser util para pesquisas mais aprofundadas:
http://www.icb.ufmg.br/mor/pad-morf/histologicabasica.htm
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http://www.icb.ufmg.br/mor/pad-morf/histologicabasica.htm
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